Von der Reformationszeit bis 1997 war das Bugenhagenhaus Sitz der Wittenberger Pfarrer und Superintendenten. Als erster Amtsinhaber amtierte hier von 1523 bis 1557 Johannes Bugenhagen. Zwischen 1604 und 1606 wurde das Pfarrgebäude aufwendig umgebaut und dabei wahrscheinlich drei oder vier kleinere Häuser zu dem langen Gebäude zusammengefügt. 1732 erhielt es das Mansarddach, weitere Renovierungen folgten von 1907 bis 1910 und von 2004 bis 2007.

Die Verbindung von Wohn- und Amtssitz, die als typisches Merkmal des evangelischen Pfarrhauses gilt, ist erst für das 17. Jahrhundert zweifelsfrei zu belegen. Ein Inventar von 1686 führt neben Wohn- und Schlafräumen, Ställen und Gesindekammern auch ein Lusthäuschen im Garten und ein Bad mit »Schwitzebank« und Wanne auf. Zu Bugenhagens Zeit werden in den Quellen nur die Lesestube und die darüber gelegene Studierstube mit der »Liberei« genannt, die sich weitgehend erhalten haben.

Die Wittenberger Stadtkirchengemeinde und die Paul-Gerhardt-Akademie nutzen das Bugenhagenhaus für Veranstaltungen. In den öffentlich zugänglichen Räumen wird an den ersten evangelischen Stadtpfarrer und seine Nachfolger erinnert.